Next Generation Sequencing - NGS
Voor het beantwoorden van een diagnostische vraag waarbij veel genen moeten worden onderzocht, is de klassieke gen-voor-gen-analyse met de Sanger-sequencing methode zeer bewerkelijk en vaak praktisch onmogelijk. Het is nu mogelijk het DNA van de patiënt te onderzoeken met behulp van Next Generation Sequencing. Alle gewenste genen, bijvoorbeeld bij het exoom alle bekende eiwitcoderende genen, kunnen met Next Generation Sequencing in één keer worden onderzocht op de aanwezigheid van ziekteveroorzakende mutaties.
Door eventueel het genetisch materiaal van de biologische ouders met dezelfde methode te onderzoeken en de resultaten te vergelijken met die van hun kind, kunnen ook nieuw ontstane ziekteveroorzakende mutaties worden gescheiden van genetische variatie die niet met ziekte is geassocieerd.
Het laboratorium van de sectie Genoomdiagnostiek biedt twee vormen van analyse met Next Generation Sequencing (NGS) aan:
- Genpaneldiagnostiek (inclusief copy number variatie (CNV) analyse), waarbij een geselecteerde groep genen, passend bij de klinische indicatie, wordt onderzocht.
- Whole Exome Sequencing, waarbij alle bekende eiwitcoderende genen worden onderzocht.
Aanvraagformulier Genpaneldiagnostiek uitklapper, klik om te openen
Aanvraagformulier DNA diagnostiek
Genpaneldiagnostiek kan worden aangevraagd als :
- gerichte gendiagnostiek niet heeft geleid tot een diagnose
- de genetische heterogeniteit van de aandoening zo groot is, dat gerichte genanalyse niet efficiënt/effectief is.
NGS genpanels - via handige zoektool uitklapper, klik om te openen
Klik hier voor inhoud en dekkingsinfo per panel
NGS genpanel specificaties - in excel formaat
Voor ieder gen dat binnen een genpanel valt wordt een CNV analyse uitgevoerd, hetgeen in zeldzame gevallen kan leiden tot een nevenbevinding.
Voor sommige genpanels zijn zogenaamde core-genen gedefinieerd. Deze genen worden getest met een aan Sanger/MLPA-diagnostiek vergelijkbare sensitiviteit (zie ook Weiss et al., Hum Mutat. 2013 Oct;34(10):1313-21). Aanvullende MLPA-analyses voor de detectie van grotere deleties en/of duplicaties zijn voor een beperkte groep (niet core-) genen ook mogelijk.
Bij genpaneldiagnostiek worden niet alle gevonden veranderingen gerapporteerd.
- Voor autosomaal dominante en X-gebonden genen worden de (waarschijnlijk) pathogene mutaties en de varianten met onbekende significantie (VUS) gerapporteerd.
- Voor autosomaal recessieve genen is de analyse vooral gericht op de rapportage van (waarschijnlijk) pathogene mutaties.
- Bij autosomaal recessieve genen worden varianten met onbekende significantie gerapporteerd als er op het andere allel eveneens een VUS of (waarschijnlijk) pathogene mutatie wordt gedetecteerd.
Als er geen genpanel beschikbaar is en/of de differentiaal diagnose geen uitkomst biedt, is eventueel exoomdiagnostiek mogelijk. Voor het aanvragen van exoomdiagnostiek is verwijzing naar een klinisch geneticus vereist.
Whole Exome sequencing (WES) uitklapper, klik om te openen
Bij exoomdiagnostiek worden alle eiwitcoderende genen onderzocht. Exoomdiagnostiek kan worden aangevraagd bij extreem heterogene aandoeningen, zoals een verstandelijke beperking of wanneer de differentiaal diagnose geen uitkomst biedt voor gerichte diagnostiek (’diagnose onbekend’). De kracht van exoomdiagnostiek zit vooral in het kunnen toetsen van overervingspatronen, waarvoor ook de analyse van het genetisch materiaal van de ouders noodzakelijk is (trioanalyse). Hiermee kunnen ook de novo mutaties (nieuwe mutaties) worden gedetecteerd. Nadeel van deze methode is dat er kans is op het detecteren van klinisch onduidelijke bevindingen en op het vinden van onbedoelde/ongevraagde bevindingen met klinische relevantie. Door de complexiteit en de mogelijkheid van nevenbevindingen is bij een WES-analyse verwijzing naar een klinisch geneticus vereist.
Bij exoomdiagnostiek worden niet alle veranderingen gerapporteerd. Voor de novo- veranderingen worden enkel (waarschijnlijk) deleterious mutaties en varianten met onbekende significantie (VUS) gerapporteerd. Voor recessieve veranderingen worden enkel de (waarschijnlijk) deleterious mutaties gerapporteerd.
NGS techniek uitklapper, klik om te openen
Eiwitcoderende genen worden door hybridisatie van het genomische DNA met een Agilent SureSelectXT capture library verrijkt uit het genomische DNA met behulp van zogenaamde oligonucleotideprobes. Deze oligonucleotideprobes (120 nucleotiden lang) zijn gericht tegen de eiwitcoderende sequentie (exonen) van genen. Na deze verrijking wordt de DNA-basevolgorde bepaald met een Illumina sequencingsysteem. Het DNA wordt hierbij in kleine stukjes van bijvoorbeeld 2x100 basen (reads) gelezen. Om mutaties op te sporen die verklarend kunnen zijn voor de klinische verschijnselen van de patiënt worden deze korte basevolgorden vervolgens geplaatst op hun positie in het humane referentiegenoom en vergeleken met deze sequentie.
Bij genpaneldiagnostiek wordt gestreefd naar een minimale dekking van meer dan 15 unieke reads (>15X) per base voor >99 procent van de eiwitcoderende basen plus 20 basen van de flankerende splice-site consensussequenties. Mutaties worden met een bio-informatisch analyseprogramma geïdentificeerd en vastgelegd. De sensitiviteit voor mutatiedetectie met deze methode is >95 procent De methode is minder betrouwbaar voor het aantonen van relatief grote (>40 bp) deleties, inserties en indels (<<5% van de mutaties).
Bij exoomdiagnostiek wordt gestreefd naar een minimale dekking van meer dan 15 unieke reads (>15X) per base voor >95 procent van de eiwitcoderende basen plus 20 basen van de flankerende splice-site consensussequenties van alle genen in het menselijk genoom. De gemiddelde dekking over deze regio is ~100X. Mutaties worden gedetecteerd door te toetsen op overervingspatroon (de novo en (X-gebonden) recessief). De sensitiviteit voor mutatiedetectie met deze methode is lager dan bij genpaneldiagnostiek, maar minimaal >90 procent De methode is minder betrouwbaar voor het aantonen van relatief grote (>40 bp) deleties, inserties en indels (<<5% van de mutaties).